基于質(zhì)譜的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)仍然面臨著一些重大挑戰(zhàn)，包括血漿蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性和寬廣的動態(tài)范圍。因此，需要先進(jìn)的樣本制備技術(shù)來富集低豐度蛋白質(zhì)，然而手動處理大隊(duì)列樣本需要大量的動手時間，不僅會降低研究速度，還會有人為錯誤的風(fēng)險。自動化技術(shù)可以解決這些難題，確保大量樣本的快速處理，同時提供可擴(kuò)展性和結(jié)果的可重復(fù)性。

ENRICH-iST試劑盒（PreOmics）工作流程為高通量和深入的血漿蛋白質(zhì)組分析提供了標(biāo)準(zhǔn)化的簡化的解決方案，通過將低豐度蛋白質(zhì)富集到順性磁珠上，有效打破了動態(tài)范圍的限制，同時保留了有價值的生物信息。富集后的蛋白質(zhì)使用iST工作流程步驟進(jìn)行酶解和純化，以進(jìn)行MS分析。

為了進(jìn)一步提高血漿樣本制備工作流程的效率，將此試劑盒與TECANFluent液體工作站相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了全自動化（見圖1），其中，F(xiàn)luent工作平臺可實(shí)現(xiàn)蛋白富集，蛋白酶解，純化，肽段濃縮干燥、重懸等一系列的工作流程（見圖2），極大限度提高了前處理效率，96個血漿樣本到干燥的多肽在6h內(nèi)即可完成。為了評估此平臺的可靠性和穩(wěn)健性，本文對多日的自動化工作流程進(jìn)行了嚴(yán)格的評估，并在一項(xiàng)研究中對其進(jìn)行了進(jìn)一步的測試，考察了兩個年齡組之間與年齡相關(guān)的血漿蛋白質(zhì)組差異。

結(jié)果分析

多日分析旨在確定日內(nèi)和日間可重復(fù)性，以評估ENRICH-iST自動化方案的穩(wěn)健性。在連續(xù)三天的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，對來自單一供體的血漿進(jìn)行處理，每次實(shí)驗(yàn)均采用相同的板布局。三天血漿樣本的TIC疊加圖顯示樣本制備都是干凈的，無論哪天的色譜分離結(jié)果都具有可重復(fù)性。此外，血漿樣本、相鄰空白樣本和LC-LOAD緩沖液對照之間的總蛋白豐度比較證實(shí)，在自動化處理過程中不存在交叉污染。

在三次實(shí)驗(yàn)中，前體和蛋白質(zhì)組的數(shù)量分別超過了12000個和1100個，比較其鑒定出的蛋白質(zhì)種類時，結(jié)果顯示有96%的重疊，表明血漿蛋白質(zhì)組的覆蓋范圍很深，且有可重復(fù)性。

為了進(jìn)一步評估定量精確度，計算了蛋白質(zhì)豐度的變異系數(shù)，并與作為參考的混合血漿樣本進(jìn)行了比較。對混合血漿多肽樣本連續(xù)進(jìn)樣五次并分析，得出LC-MS儀器的變異系數(shù)中位數(shù)為10%CV。對單個血漿樣本進(jìn)行日內(nèi)分析發(fā)現(xiàn)，三次實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)中位數(shù)分別為15%、14%、16%。這表明樣本處理過程中涉及的因素對總體變異系數(shù)中位數(shù)影響很小。此外，日間比較顯示所有實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)中位數(shù)為16%，更加表明此自動化工作流程對血漿分析的定量非常可靠。

最后，對兩個健康年齡組的年齡依賴性血漿蛋白質(zhì)組進(jìn)行了差異分析，在六個個體中，鑒定出的蛋白質(zhì)組平均數(shù)量（約1700個蛋白質(zhì)組）非常一致，進(jìn)一步證明ENRICH-iST自動化工作流程的穩(wěn)健性。差異分析顯示年輕或年長供體中存在差異調(diào)控的多個蛋白質(zhì)。據(jù)報道，差異調(diào)控的蛋白質(zhì)中有8種是受年齡調(diào)控的（紅色標(biāo)記），其中包括GDF15（一種已確立的衰老生物標(biāo)志物）和熱門的CHI3L1（已被證明會隨著年齡而升高）。

結(jié)論

Fluent自動化液體工作站可成功實(shí)現(xiàn)ENRICH-iST樣本制備技術(shù)自動化流程，極大限度的減少了人工操作的步驟，整個流程僅需6小時，可在一個工作日內(nèi)輕松制備96份樣本。此自動化工作流程為具有挑戰(zhàn)性的血漿蛋白質(zhì)組制備領(lǐng)域提供了一種實(shí)用的簡化的解決方案，使研究者可以深入了解分子機(jī)制，并在小型和大型隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。